使用iPSC衍生的视网膜类器官对RP2视

强调

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等基因RP2基因敲除与RP2患者类器官的表型匹配

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RP2无效的视网膜类器官经历杆感光细胞死亡

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细胞死亡与杆感光细胞分化相关

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AAV基因疗法改善了感光细胞的活力并增加了视紫红质的表达

摘要

RP2突变导致X连锁性视网膜色素变性（XLRP）的严重形式。RP2相关的视网膜变性在人类中的机制尚不清楚，并且RP2XLRP的动物模型不能概括这种严重的表型。在这里，我们开发了基因编辑的等基因RP2基因敲除（RP2KO）诱导多能干细胞（iPSC）和RP2患者来源的iPSC，以产生3D视网膜类器官作为人类视网膜疾病模型。令人惊讶的是，RP2KO和RP2患者来源的类器官在第天（D）出现杆感光细胞死亡的高峰，随后通过培养D使类器官外核层（ONL）变薄。带有人RP2的腺相关病毒介导的基因扩增挽救了RP2KO类器官的变性表型，以防止ONL变薄并恢复视紫红质的表达。值得注意的是，这些数据表明3D视网膜类器官可用于建模感光器退化并测试潜在的疗法以防止感光器细胞死亡。

图形概要

介绍

将患者来源的细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSC），使得能够衍生和分化一系列体细胞类型，并彻底改变了我们研究遗传性疾病的能力（Takahashi等人，）。近年来，随着3D视网膜类器官（RO）生成协议的完善，iPSC向视网膜谱系的分化取得了巨大进步（Gagliardi等，;Nakano等，）。与以前的2D模型不同，这些3D结构包含具有形态可识别特征的感光体。包括线粒体丰富的内部部分，具有连接纤毛的基本外部部分和突触椎弓根，以及双极，Müller胶质细胞，神经节和无长突细胞，突触层和外层限制膜（OLM），它们排列在视网膜层中（已审查）在Capowski等人，年）。这些先进的模型已被证明具有许多翻译研究应用，包括移植研究（Gonzalez-Cordero等人，；Shirai等人，），视网膜疾病建模以及测试人类感光细胞中潜在疗法的功效（邓等人，，Parfitt等人，，Schwarz等人，，Sharma等人，）。然而，迄今为止，它们尚未用于建模和挽救光感受器细胞死亡。

RP2突变约占所有X连锁性视网膜色素变性（XLRP）病例的15％（Breuer等，；Hardcastle等，）。RP2是小GTPaseARL3的GTPase激活蛋白（GAP）（Veltel等，），也受鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）ARL13B的调节（Gotthardt等，）。ARL13B定位于睫状轴突，而RP2和ARL3则位于基体，相关的中心体位于感光体的底部（Evans等，；Grayson等，）。ARL3及其效应子（UNC和PDEdelta[PDED]）和GAPRP2被认为在视网膜中将脂化蛋白（例如转导蛋白，GRK1和PDE6）运输到感光器外部很重要（Ismail等，，Schwarz等，，Wright等，，Zhang等，，Zhang等，）。与人类疾病相比，Rp2基因敲除小鼠具有相对较轻的表型。在一个模型中，在14个月时就出现了GRK1和视锥细胞PDE6a的错误定位/缺失（Zhang等人，），而另一种模型据报道在2个月时视紫红质和视蛋白M的定位错误以及在外核层（ONL））在5个月时变薄（Li等，）。相比之下，人类表型相对较重，一些患者在童年时期经历了黄斑萎缩（Jayasundera等人，），突显了人类视网膜疾病模型的必要性。

当前没有针对这种情况的疗法，因此需要开发潜在的疗法。从iPSC衍生的RPE和携带RP2无意义突变的个体（c.CT，p.RX）的早期RO的表征显示高尔基体内聚力的改变，RPE中Gbeta的运输以及RO中KIF7的睫状运输（Schwarzetal。，，Schwarzetal。，）。此外，通读药物G和/或Ataluren（PTC）的治疗可以恢复可检测的全长RP2蛋白，并挽救iPSC-RPE中高尔基体的内聚力和Gbeta错定位以及RO中的驱动蛋白运输。在动物模型中，经视网膜下注射后，使用腺相关病毒（AAV）对其他遗传性视网膜疾病的基因治疗已被证明可以有效地转导感光细胞和RPE（Sarra等人，）。有美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局批准的AAV介导的眼基因疗法（Russell等人，），并且许多AAV介导的眼基因疗法目前处于I/II和III期临床试验中（clinicaltrials.gov）。将人RP2的AAV递送至RP2-XLRP的小鼠基因敲除模型可保持锥体功能，但对杆状细胞功能无影响，并且在较高病毒剂量下观察到毒性（Mookherjee等人，）。

在这里，我们描述了CRISPR基因编辑的RP2敲除RO相对于它们的同基因控制的时间成熟，以及来自具有相同RX无意义突变的两个无关个体的RO。这些研究表明，RP2的丢失导致棒状感光细胞变性，可以通过AAV递送RP2来挽救。

结果

RP2敲除和RP2患者iPSC发育成熟的RO

来自两个无关的个体（RX-A和RX-B）的成纤维细胞携带无意义突变c.CT；通过核转染将p.RX重编程为iPSC（Okita等，，Schwarz等，）。CRISPR/Cas9带有设计为靶向RP2外显子2的向导，用于通过同时重编程和基因编辑方案生成RP2敲除iPSC（Howden等人，）。选择gRNA在外显子2上的位置，是因为它接近c.CTp.RX位点，因此，产生的任何敲除品系都会紧密模拟这种无意义的突变的后果。RP2KOiPSC克隆是通过非同源末端连接介导的插入缺失创建的。选择了一个在RP2外显子2中具有8bp缺失的克隆（RP2c._delAAGCTGGA；p.LysSerfsTer11），因为它在提前终止密码子之前具有最短的移码延伸，因此需要进一步研究。iPSC的蛋白质印迹显示出有效的敲除，因为未检测到RP2蛋白（图1A和1B）。

使用以前描述的方法（Nakano等，；Zhong等，），将RP2KO系，未经编辑的等基因对照和2个RX患者iPSC系在4-10个月内分化为RO。稍作修改。两种方法均产生了生物学上相似的类器官，它们在测试时间点上在发育和结构上均具有可比性。在第天（D），通过光学显微镜可以看到带有刷状边框的透明ONL（图1C）。首先从D开始在回收蛋白阳性ONL的对照类器官中检测到视紫红质阳性细胞散布，然后随着RO的成熟直至D随着时间的推移而增加数量（图S1A）。到D为止，所有细胞系都能够在包含蛋白激酶Cα（PKCα）阳性的内核层（INL）上方生成由具有压紧ONL的层压结构组成的RO，其中ONL包含Recoveryin和视锥蛋白抑制蛋白阳性的感光体（图1D）。双极细胞和CRALBP/Nestin阳性Müller胶质细胞（图S1B）。在所有RO中，ONL终止于顶端边缘，其OLM对F肌动蛋白具有强免疫反应性（图1D）。在OLM上方，线粒体（对TOM20具有免疫反应性）富含球状内部节段。睫状标记物ARL13B和聚谷氨酰微管蛋白（GT）的免疫染色显示，在连接纤毛的感光器尖端，其形状逐渐膨胀，从D起逐渐形成外段（OS）样结构（图S1C）。可以在INL和ONL中所有细胞的质膜的对照RO中检测到RP2。在RP2KO和RX细胞系中，尽管在推测的OS边缘观察到一些背景荧光，但免疫细胞化学（ICC）却没有RP2免疫反应性。使用qPCR测量D处RO中相对RP2mRNA的表达。RP2KO克隆相对于其同基因对照仅具有20％RP2mRNA，类似于RX患者的RO（n=3）（图1E），这表明突变等位基因转录物在所有这些RO中均受无义介导的降解作用。电镜证实在对照和RP2KOROs中，在顶端睫状尖端存在膜丰富的结构，让人想起早期的OS（图1F）。经常发现这些基本的OS与RO的主体分离，这表明在没有RPE的情况下这些结构的灵活性或脆弱性。总的来说，这些结果表明，RP2切除并不能阻止iPSC分化为3DRO培养中带有OS样结构的感光细胞。

RP2的丢失导致感光细胞死亡和ONL变薄

与体内的神经视网膜类似，RO的最外层细胞层由均匀的致密ONL组成，该层以感光突触椎弓根终止，该突触椎弓根通过对外丛状层中的突触结构蛋白Bassoon具有免疫反应性的层与视网膜内细胞隔开（图2A）。体内ONL中感光核数目的减少以及由此厚度的减少是感光细胞变性的标志。因此，在等基因对照和RP2KO中在D，D和D处测量了ONL厚度（图2B）。在对照RO中，平均ONL厚度在D和D之间从20μm增加到25μm，然后在D和D之间没有明显变化。相反，在RP2KORO中，平均ONL厚度在D和D之间显着降低（p=0.02）。同样，与对照细胞系相比，两名患者的RXRO在D时的ONL明显更薄（p≤0.01；图2和S2）。这表明在RP2无效细胞系中D和D之间可能发生光感受器细胞死亡。

与RP2缺失相关的基因表达变化

为了研究可能与RP2无效类器官中的感光细胞死亡相关的基因表达变化，对D对照，RP2KO和RX-ARO进行了RNA测序（RNA-seq）。主成分分析和样品到样品的距离表明，RP2KORO的基因表达谱位于RX-A患者株系与父母同基因对照之间（图2E和2F）。与对照相比，RP2KO和RXRO之间共有个共享的差异表达（DE）基因（图2G-2I）。相比之下，在对照与RP2KO和RX-ARO之间分别有和个DE基因不共享。对共享的DE基因进行的京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径分析显示，“p53信号传导途径”是主要的上调途径，而主要的下调途径是“轴突指导”（图2J和2K）。对轴突引导相关变化的KEGG通路分析表明，刺激轴突生长，吸引和排斥的通路中的基因表达降低了（图S3）。而对KEGG细胞凋亡和p53信号通路的进一步研究表明，在两个RP2无效RO中，许多促凋亡基因（例如p21，BAX和PUMA）均被上调（图S3），支持观察到RP2缺失诱导RO中的细胞死亡。

RP2KO和RXRO中的杆感光细胞分化和存活受到损害

为了确定哪种类型的感光细胞受RP2的损失影响最大，在视锥细胞和视锥细胞在D处用视紫红质和视锥细胞抑制蛋白进行染色（图3A）。令人惊讶的是，与同基因对照相比，在RP2KOROs中，视紫红质的免疫反应性降低了。与在RP2KORO中广泛存在的恢复蛋白表达不同，视紫红质只限于ONL的斑块。为了评估光感受器基因表达，我们通过qPCR定量了视紫红质（RHO）和棒转导蛋白（GNAT1）的表达。在对照中，RHO和GNAT1均显示出年龄依赖性的增加，在D和D之间显着增加。相反，RP2KOROs在D处RHO和GNAT1mRNA的表达降低，但在D或D处却没有，表明从D以后开始就表现出这种差异。对视紫红质具有免疫反应性的光感受器的百分比被定量为所有RO的切片中ONL全长上DAPI阳性核的百分比（图3C）。对照组显示，随着RO的成熟，视紫红质阳性细胞增多。尽管各个RO之间存在差异，但在同基因对照和RP2KO细胞系之间，成熟RO（D）中视紫红质表达细胞的百分比存在显着差异（图3A和3C）。此外，两条RX品系在D处也显示出很少的视紫红质阳性受体，与RP2KORO相似（图3C）。相比之下，与D的对照组相比，RP2KO和RXRO中的视锥细胞抑制素阳性细胞的百分比显着增加，而D和D的RP2KORO中的mRNA（ARR3）也有所增加（图S4），这表明该缺陷主要影响棒而不是锥体。对照和RP2KORO之间的双极细胞数（Chx10/PKCα）没有显着差异（图S4）。为了排除这些差异可能仅归因于细胞系之间成熟速率的延迟，将对照和RP2KORO在培养至D的过程中再维持天。相对于D的对照RO，RP2KO的视紫红质阳性细胞较少，而恢复素阳性的感光细胞得以维持（图3E）。

AAV2/5有效地将RO转导至增强RP2空感光器中的RP2表达

AAV能够在视网膜下注射后（Sarra等，）和RO中iPSC衍生的杆和锥型光感受器在小鼠中转导有丝分裂后的杆和锥（Gonzalez-Cordero等，）。为了评估AAV将RP2输送到缺陷型感光细胞的能力，在观察到ONL变薄之前，在D用AAV2/5.CAGp.RP2（图4A）转导了RP2KORO，并在D收获。在D，ICC可以在整个ONL中检测到RP2蛋白（图4B）。在更高的放大倍数下，在感光器的质膜上检测到RP2信号（图4C）。RP2阳性细胞的百分比是通过在与该细胞形态相匹配的质膜上对紧邻的RP2信号进行核计数来确定的。ONL的转导效率为90％±7％（图4D）。这包括视紫红质阳性的杆状细胞（图4E）和视锥蛋白抑制素阳性的视锥细胞（图4E）。在视网膜内层中也可以看到零星的RP2染色，表明一小部分AAV能够穿透RO并转导视网膜内细胞（图S5）。通过qPCR对mRNA水平进行的分析显示，相对于对照类器官，RP2转录本平均增加了55倍（图4F）。

AAV2/5驱动的RP2基因增强可提高感光细胞的存活率

为了研究RP2水平的增加是否改变了ROs的退化表型，比较了D时RP2AAV转导的RP2和未转导的RP2KOROs的ONL厚度和视紫红质免疫反应性（图5A和5C）。用恢复蛋白和巴松管将ONL染色（图5A）。ONL的测量显示，在D处，AAV-RP2转导的RP2KO类器官比未转导的对照具有显着更厚的ONL（p≤0.01，图5B），并且感光细胞的数量增加（图S5）。转导后的ONL厚度与D等基因对照细胞观察到的相似，表明几乎可以完全拯救。在大多数（但不是全部）转导的类器官中，视紫红质阳性细胞的百分比高于未转导的RP2KO的平均值，这表明AAVRP2表达可以恢复视紫红质的免疫反应性（图5D）。在mRNA水平上也观察到了这一点，转导的RO中RHO水平增加了多达3倍。但是，一个转导的RO在视紫红质表达水平上没有显示任何反应（图5E）。AAV转导后视锥细胞抑制素阳性细胞的百分比也降低了，但ARR3mRNA不变（图S5）。

讨论区

在这里，我们描述了RP2XLRP的体外模型，并表明RP2的AAV基因扩增可以成功逆转可测量的和临床相关的疾病表型。iPSC重编程，CRISPR基因编辑技术和AAV基因传递的结合使RP2KO，同基因对照和XLRP患者RO并排比较，从而消除了iPSC派生的类器官模型的某些固有变化。

iPSC的分化为探索受特定基因变化影响的细胞和组织中的遗传疾病机制提供了机会。对于普遍表达的基因（例如RP2），其疾病病理仅限于特定组织（例如视网膜），这尤其有用。在这里，我们将iPSC重编程技术与CRISPR/Cas9基因编辑结合使用来探测了RP2XLRP中的疾病机制。

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