ARVO访谈新型敲除基因NP

　　国际眼科时讯:Dr.Baehr，您在昨天演讲结束后提到您已经制作出新的小鼠模型，您能谈谈具体细节么？

Dr.Baehr：新的小鼠模型为NPHP-5(即nephrocystin5)基因敲除小鼠。Nephrocystin是在初级纤毛表达并定位于微管组织中心基体内的蛋白。基因敲除小鼠会存在肾结核和视网膜变性。该蛋白实际上不执行任何其他的信号功能，只是与基体相关联。而基体与组建轴丝的分子相互交通，所以该蛋白参与连接纤毛形成，不参与轴丝伸展。轴丝是微管的建成形式，NPHP5组织分子交通，沿着轴丝运送微管，从而延长轴丝，这是属于它的功能。对于视网膜变性的动物模型来说，小鼠天生完全失明，是因其视网膜不能形成感光信号。

国际眼科时讯：您能和我们谈谈怎样将该疾病的小鼠模型应用于临床研究么？

Dr.Baehr：应用于临床正是制作这种基因敲除小鼠模型的目的。我们还制作了基因替代的小鼠模型，其视网膜内有NPHP5，我们希望NPHP5能够逆转变性。有个问题就是如果想变性进展较快的话，需要使用逆转技术。利用转录因子可以制作NPHP5基因敲除小鼠模型，该转录因子不表达时可以阻止视杆细胞和视网膜中独存的视锥细胞的变性。而之所以选择仅有视锥细胞的视网膜，是因为该小鼠的视锥细胞比视杆细胞存活时间长。目前有很多方法逆转变性，例如可以转染携带治疗基因的病毒，该方法在几天内即可使基因在视网膜中表达，从而逆转视杆细胞变性。常规上视锥细胞是比视杆细胞更加重要，但这不适用于小鼠，因为它们是夜行动物。我们最终的目标是从人体皮肤细胞中筛选出干细胞。我们从有家族史的患者得到皮肤细胞并培养它们，从中选出干细胞，将其诱导为光感受器细胞，最后将光感受器细胞植入人视网膜中。这只是一个构想，迄今为止还无法做到。但是在小鼠上我们可以逆转视锥细胞变性，甚至可以制备出干细胞做治疗。在小鼠模型中我们可以尝试试验各种办法，因此这些方法在小鼠体内比较容易实施，干细胞诱导为光感受细胞的数量也比较容易达到，但最终的目标还是应用于人。

　　国际眼科时讯：视杆和视锥细胞已进化为高度极化结构。您能和我们谈谈该光感受器的特殊结构及其相应功能吗？

Dr.Baehr：特殊之处就是它们是极化的细胞，视杆和视锥细胞由内节、连接纤毛、外节组成。视锥细胞是进化中原始的视觉细胞，而视杆细胞是后期形成的细胞。当动物进化到陆地生存后，这些细胞已经进化成熟。所有的水生鱼类均有视锥细胞感知色觉，当鱼类转到划分昼夜的陆地生存后，它们需要夜视，就形成了视杆细胞。进化过程经历了4亿年，但是两者结构是一致的，连接外节和内节的是同一突触。外节有包含感受器的膜盘，可以感受光刺激。视杆细胞膜盘中的视紫质将光信号转化为细胞的通道关闭、超极化、电位复极化等电信号，从而将刺激传递到视网膜。所以仅拥有视网膜我们是无法看到事物的，它仅产生电冲动，而位于大脑后部的视皮质产生画面。我们都知道仅凭眼睛我们看不到眼前的画面，它其实是在大脑产生的。视杆和视锥细胞产生一系列电冲动，但两者的敏感性不同。视杆细胞对事物比较敏感，如果一个人意识正常，就可以看到完整画面。视杆细胞功能正常情况下，视觉也是正常的，如果存在功能缺陷，就会产生夜视障碍、色素性视网膜炎。基因也会出现缺陷，随之会出现严重的问题，比如色素性视网膜炎、黄斑变性或非进展性疾病，比如夜盲。夜盲患者看电影时可以看到屏幕，但是看不到旁边的人。如果突然发生色素性视网膜炎，那么患者能看到前方，看不到周围。考取驾证时，夜视检查中如果您不能看到指示灯闪烁，提示您需要找眼科医师检查视网膜了。医师会给你一些建议，比如夜晚不要驾车，如果情况加重，任何时间都不要驾车。

　　国际眼科时讯：您能谈谈哺乳动物视杆和视锥感受器中膜蛋白转运机制及其在视光学疾病中的作用吗？

Dr.Baehr:转运机制有两种，一种是附着的可溶性蛋白，形成了可溶性复合体。细胞信号产生后，该蛋白直接从内质网转运至连接纤毛，并入到膜盘的底部。而膜体采取另一种转运机制，它的形成则不同，是由核糖体合成后附着于粗面内质网，且是不可溶的。膜体是迁移在膜上的蛋白，在内质网包裹成小泡后移至高尔基体。微管作为外节的一部分，参与了上述过程，且微管流存在于所有器官的细胞中。微管的负端位于细胞基体，另外一端位于外周，所以有的蛋白移向负端，有的移向正端。有观点认为该囊泡泵出后沿着微管移向负端，它们首先与高尔基体融合，穿过高尔基体网络，之后的去向则根据细胞的突触及外层结构，但是蛋白的编码序列决定了它们是接受外部信号还是转移至突触末端。

　　国际眼科时讯：编码序列是真的编码序列还是其他？

Dr.Baehr：它实质上一个蛋白特异的由3-4个氨基酸组成的序列，是一个特征蛋白。视紫质有4个氨基酸，称为VxPx，V代表缬氨酸，P代表脯氨酸，x代表任意氨基酸，这就是保守序列。缺乏该序列，会导致视紫质功能障碍。某些蛋白转运的物质类型是由保守序列决定。它们产生后转移至连接纤毛的底部，与细胞膜融合，之后组装为囊泡形式释放。囊泡内包含了需转运至微管负端即外节部分的所有蛋白，而有的囊泡以另外的方式转移至微管正端，有的先是转移至负端，后又移至正端。这是激酶的作用，研究激酶有些复杂，视杆细胞上的作用机制尚不清楚，视锥细胞的激酶以两种形式转运所需的蛋白。而两者细胞的区别是什么，为什么会产生差异呢？因为在进化上，视杆细胞更早、细胞更大，它的外节较长，约个膜盘，所以它需转运更多物质，需要更大的转运体来运载所有蛋白。视锥细胞需要的转运体较小。每天需转运的视紫质量是可以计算的，约万视紫质分子，而需转运体为其10％，约24万。而在华盛顿大桥上，每天的经过车辆只有24万。

　　国际眼科时讯：所以细胞内比华盛顿大桥还拥挤？

Dr.Baehr：是的，经过连接纤毛和光感受器的物质的数量可能比华盛顿大桥上的车辆还要多。一旦蛋白转入，则产生新的膜盘，不过具体原理还是谜，现如今没有人能确定膜盘的产生机制。有人认为细胞膜以“之”字形叠成相同的膜盘，由于膜盘只是堆叠的，所以它们没有连接到膜。想象一下，在细胞的底部有几百个膜盘，每天需更新80个，在电子显微镜下都看不清。我们的一个课题就是研究膜盘的发生机制。

　　国际眼科时讯：您现在的另一个研究课题是关于遗传性疾病，比如Senior-L?ken综合征(SLS)，您能谈谈SLS以及能够影响光感受器的基因突变吗？

Dr.Baehr：SLS是一个严重的疾病，该病患者需要肾移植，而医师却无能为力，所以我们不仅只 　　国际眼科时讯：对SLS的系统治疗就是对纤毛的治疗吗？

Dr.Baehr：这种治疗方法不只限于视网膜。可将携带缺失基因的病毒注射至视网膜下腔（位于光感受器和色素内皮之间），基因通过视网膜表达，表达足够多的蛋白，可以在周边持续检测到。病毒疗法只是暂时的，患者需要一年进行一次注射。因为病毒生存在浅层，所以频率最好是一年一次。该层有质粒表达，但质粒是不稳定的。如果病毒能够将所携带基因整合至基因组内，基因表达将时间更长、更有效，但问题是如果基因整合位置不当，那么我们就希望病毒能够生存于浅层，只稳定表达一年，之后便将它替换。而干细胞可以增殖和分化为光感受器，整合入视网膜，从而稳定表达。

来源：《国际眼科时讯》编辑部