人诱导的多能干细胞产生视网膜色素上皮细胞

论文作者：

KeYe,Yutotakemoto,Arisaito,Masanarionda,naoMorimoto,,MichikoMandai

MasayotakahashiRyujiKatofumitakaosakada

来自：名古屋大学药学研究科细胞药理研究室，日本理化研究所视网膜再生实验室，神户市眼科研究所

翻译/整理：清俹

人诱导多能干细胞（hiPSC）视网膜色素上皮（RPE）移植是治疗RPE变性（如年龄相关性黄斑变性）的一种有前景的细胞治疗方法。然而，目前的RPE替代疗法面临重大挑战。从hiPSC来源的细胞中选择不同的RPE需要一个繁琐的手工过程，尽管RPE细胞团的质量差异很大，但是没有有效的方法来区分功能性RPE片层和不适合移植的RPE细胞。为了克服这些问题，我们开发了从hiPSC生成RPE细胞片和基于图像的评价方法。我们发现，用六种信号通路抑制剂和烟酰胺的逐步处理提高了RPE细胞差异化效率（RPE6iN），使RPE片层在无需人工选择的情况下高纯度地生成。基于F-肌动蛋白标记的RPE图像的细胞形态学特征，建立了机器学习模型，用于预测RPE片层功能的一个指标——经皮电阻值。我们的模型在识别低质量的RPE片层来消除问题上是有效的，即使在使用无标签图像时也是有如此的效果。基于RPE6iN的RPE片材生成与基于无损图像的预测相结合，为大规模生产批量变化的纯RPE片材提供了一个全面的新的解决方案，并将有助于RPE替代疗法的进一步发展。

人类多能干细胞（hPSC）[人类胚胎干细胞（hESC）和人类诱导多能干细胞（hiPSC）]具有自我更新和多潜能的能力，因此它是再生疗法的重要来源。利用hPSC进行视网膜再生是干细胞再生疗法的一个新的有前途的治疗方法。视网膜色素上皮（RPE）细胞在视觉和视网膜功能维持中起着重要作用。对于年龄相关性黄斑变性（AMD）和Stargardt病患者，移植hPSC制备的RPE悬液或RPE片被认为是安全和潜在有效的。然而，这种治疗面临着移植治疗用RPE产品纯度和质量控制方面的挑战。细胞制品的性质完全不同于化学药物的性质，而化学药物在药物开发的合成和质量控制中已经得到了广泛的应用。为了促进细胞治疗的产业化，需要新的方法来解决批量生产具有批次差异的细胞产品的问题。

为了从hPSC高效生产RPE细胞，许多小组（包括我们的小组）已经开发出各种方案，仅使用生长因子蛋白或与小分子的组合来概括视网膜发育6–12。已经开发出基于小分子的分化方案以用于临床应用，但是其效率和纯度仍然很低13，14。由于仅纯RPE可以用于移植，因此有必要进一步纯化诱导的RPE，这通常是通过在显微镜下观察RPE的沉淀来手动选择来实现的4。但是，这些程序需要经验丰富的操作员，不适合大规模RPE生产。为了再生医学的进步，我们需要开发出大规模获得纯RPE片材的有效方法。

另一个问题是用于移植治疗的hPSC衍生细胞产品的质量控制。细胞产品的质量因批次而迥异。细胞产品的批次间差异源于活细胞的性质以及人类的手动操作15，16。在移植前需要确定每种细胞产品的质量至关重要。当前，细胞产物的质量通过常规方法来测定，例如基于DNA/RNA的测定和免疫标记，它们会破坏细胞产物本身并且不适合移植治疗。ELISA和跨上皮抵抗性（TER）测量是评估RPE床单功能的标准方法17，但它们的吞吐量低且耗时。预期基于显微图像的分析将有助于评估细胞产物18。已经有文章发布了基于显微镜观察RPE细胞色素沉着程度的功能预测模型19，20。细胞的形态学特征包含有关细胞状态的附加信息，通常用于细胞的日常监测。虽然我们以前已经建立了机器学习模型来估计其他细胞产品的质量21,22，但是缺乏一种基于RPE细胞形态特征的无损定量预测方法

在此，我们开发了一个从hiPSC高效生成纯RPE细胞片层的协议。用六种信号通路抑制剂和烟酰胺逐步治疗hiPSC能有效地诱导RPE分化（RPE6iN）。将RPE6iN诱导的RPE细胞移植到Transwell系统生产的高纯度成熟RPE片层上，无需人工选择。我们发现成熟RPE片材之间的阻隔功能存在批次间的差异，与先前研究19、23中报告的一般问题一致。为了支持RPE板材的稳健生产能力，我们开发了一个基于机器学习的预测模型，仅从微观图像中未标记的细胞形态来预测失效样本。这种分化方法与基于机器学习的评价模型相结合，将有助于再生细胞治疗用RPE片的高效生产和质量管理。

烟酰胺提高了hiPSC衍生的RPE细胞的纯度。hiPSC的三个细胞系（克隆D6、D2和A）均保持在无饲养层和无异种条件下24。这些hiPSC菌落表现出典型的特征，细胞紧密堆积且细胞核较大（图S1A，B：D6）。为了确定hiPSC是否是多能的，对多能干细胞的标志物OCT4进行了免疫染色，确认每个hiPSC菌落均表达OCT4（图S1C：D6）。凝集素rBC2LCN与未分化的hESC和hiPSC的细胞表面上的独特聚糖结合25，并用rBC2LCN-若丹明染色也显示所有菌落均为rBC2LCN阳性（图S1D：D6）。两条线D2和A也表示OCT4（图S1E，F）。这些结果表明，本研究中使用的hiPSC在无饲养层的条件下保持了多能状态。

为了从hiPSC诱导RPE，我们的目标是在发育过程的各个阶段逐步诱导外胚层细胞，视网膜祖细胞和RPE（图1A）26，27。我们优化了双重Smad抑制方法，有效诱导hPSC的外胚层28。在第0天到第6天之间，将BMP信号抑制剂LDN（LDN，nM）和TGF-β信号抑制剂A83-01（A83，nM）添加到培养基中（图1A）。从第0天到第6天，同时加入Wnt/β-catenin信号抑制剂IWR-1-endo（IWR，1M），以促进视网膜分化。用ROCK抑制剂Y-（10M）处理细胞直至第18天，以抑制细胞死亡29。随后用GSK3β抑制剂CHIR（3M）和bFGF受体抑制剂SU（2M）处理诱导的细胞（图1A)）因为Wnt信号激活会促进RPE分化9，30和FGF信号传导阻滞抑制神经视网膜分化9，31。为了确定hiPSC是否分化为RPE谱系，我们对PAX6进行了免疫染色，PAX6是视泡和视杯内外层的标志物32和MITF，这是视泡和视杯外层的标记33。在第12天观察到MITF和PAX6双阳性细胞（图1B），表明在我们的分化条件下，hiPSC分化为RPE祖细胞。为了诱导色素沉着的RPE，我们从第24天起就将培养基改为RPE维持培养基，当诱导的细胞采用具有鹅卵石外观的多边形形态时。用鬼笔环肽-若丹明进行F-肌动蛋白染色可观察到多边形肌动蛋白束的形成（图1C）。e多边形细胞在第35天积累了色素沉着（图1D)。然而，在第35天也观察到一些具有神经突起样结构的非色素细胞（图1E）。由于神经视网膜前体细胞和视网膜色素上皮祖细胞都来自共同的祖细胞，因此被污染的非RPE细胞可能是神经视网膜祖细胞9。我们通过对CHX10（神经视网膜祖细胞34的标记物）和MITF的免疫染色来检测受污染的非RPE细胞是否是神经视网膜祖细胞。在第35天，少数细胞CHX10阳性，MITF阴性（图1F），表明非RPE细胞是与hiPSC的RPE细胞一起诱导的神经视网膜祖细胞。这些结果表明，小分子分步处理能有效地诱导视网膜色素上皮祖细胞和红细胞视网膜色素上皮细胞，但有少数神经视网膜祖细胞。

图1.基于小分子的RPE与hiPSC的区别。（A）从hiPSC进行RPE分化逐步治疗的时间表。添加了Y（10μM），LDN（LDN，nM），A83（A83-01，nM），IWR（IWR-1-endo，1μM），CHIR（3μM）和SU（2μM）。在指定的时间段内移入培养基。（B）从hiPSC产生RPE祖细胞。处理第12天的分化细胞，对PAX6和MITF进行免疫染色。（C）从hiPSC产生多边形细胞。处理第32天的分化细胞进行鬼笔环肽染色。（D）从hiPSC生成RPE。在第35天，已分化细胞的宏观摄影图像（le）和相衬图像（右）。请注意，大多数细胞是有色的和多边形的。（E）从hiPSC共诱导非RPE细胞。虚线标记未着色的细胞（le）。箭头指示第35天时除RPE以外的分化细胞的神经过程样结构（右）。（F）少数神经视网膜祖细胞。在第35天，对MITF（RPE祖细胞的标记）和CHX10（神经视网膜祖细胞的标记）进行代表性免疫染色。虚线标记CHX10阳性细胞。比例尺：20m（B，C），50m（D，F）和m（E）。

为了从hiPSC诱导纯RPE，我们接下来试图在上述方案中消除神经视网膜祖细胞。烟酰胺（NIC）促进RPE分化7，8，12，14;因此，我们从一天开始添加了NIC（10mM）检查其对RPE分化的影响（图2A）。RPE祖细胞制造商MITF的免疫细胞化学分析显示，NIC治疗在第18、24（图S2A）和35（图2D）日显着增加MITF阳性细胞，而在NIC处理第35天显着增加MITF阳性细胞的百分比为97.2±0.27％（图2B）。值得注意的是，在NIC处理的第35天，我们观察到更多具有多角形形态的细胞和更少的非色素沉着细胞（图2C)。12NIC治疗从第12天到第24天显著减少了第35天CHX10阳性细胞的数量（图2D，E）。我们还发现NIC处理促进了PAX6和MITF双阳性细胞向MITF阳性和PAX6阴性细胞的转化（图S2B-E），表明NIC促进了RPE的分化。qPCR分析显示酪氨酸酶（一种负责RPE色素沉着的酶）在NIC治疗的第24天上调（图2F）。结果表明，NIC通过促进RPE分化和抑制神经-视网膜分化，诱导高纯度RPE细胞。

为了获得有色素的RPE细胞，我们进一步在RPE维持培养基中培养hiPSC来源的细胞，以促进RPE的色素沉着。F-肌动蛋白染色显示色素细胞形成多边形肌动蛋白束（图2G）。e诱导的细胞表达紧密连接标记物ZO-1（图2H）。大多数诱导细胞在第35天积累了更多的色素沉着（图2I）。这些结果表明，我们的分化方案从hiPSC产生了色素RPE。我们将用6种信号通路抑制剂RHOi、BMPi、TGFi、WNTi、FGFi和GSK3βi以及NIC逐步处理分离的hiPSC的RPE分化方法称为“RPE6iN”。

为了确定RPE6iN方法的稳定性，我们用三组独立的实验评估了该方法的重现性。在每个实验试验中，RPE6iN处理的hiPSC持续诱导MITF阳性的RPE祖细胞和色素细胞（图S3A，B）。这些结果表明，RPE6iN法能持续诱导高强度骨髓间充质干细胞的RPE，且变异性很小。接下来，我们研究了利用克隆D6开发的RPE6iN方法是否可以诱导其他hiPSC系的RPE分化。我们用另外两个独立的hiPSC株系（克隆D2和A）用RPE6iN法检测差异性。e三个细胞系的RPE分化结果相似；克隆D2的MITF阳性率为82%，克隆A的MITF阳性率为76%，克隆D6的MITF阳性率为75%（图S3C，D）。三个独立品系间的RPE分化效率具有可比性。我们的结论是，RPE6iN方法可以在多个hiPSC株系中获得高重复性和低变异性的纯RPE细胞。

图2.通过RPE6iN方法有效生成纯RPE。（A）新的区分方法RPE6iN的时间表。解离的hiPSC在存在Y（10μM），LDN（LDN，nM），A83（A83-01，nM），IWR（IWR-1-endo，1μM），CHIR（3μM）和SU（2μM）在指定时间段内。从第12天到第24天，将NIC（烟酰胺，10mM）添加到培养基中。（B）通过NIC处理促进RPE分化。通过在第12、18、24和30天对MITF进行免疫染色来确定MITF阳性细胞的百分比，与对照相比，**P0.01，***P0.。（C）在第35天，有或没有NIC处理的诱导细胞的相差图像。虚线标记未染色的细胞。请注意，NIC处理可减少非色素区域。（D）代表性的显微照片，显示了RPE6iN处理的hiPSC。在有或没有NIC的情况下对HiPSC进行区分，在第35天进行固定，然后对MITF和CHX10进行免疫染色。（E）在第35天，通过NIC处理，CHX10阳性细胞的百分比降低。与对照相比，***P0.。（F）通过NIC处理促进RPE成熟。在第24天通过RT-qPCR定量酪氨酸酶的基因表达。与对照相比，***P＜0.。（G）从RPE6iN处理的hiPSC产生多边形细胞。在第31天处理分化的细胞进行鬼笔环肽染色。（H）在RPE6iN处理的hiPSC中形成紧密连接。在第35天，对RPE6iN染色的细胞进行RPE6iN染色的细胞免疫染色。（I）在培养的35天，对RPE6iN染色的色素细胞的宏观摄影图像和相差图像。RPE6iN处理的细胞在RPE维持培养基中培养。比例尺：20m（G，H），50m（D，I）和m（C）。

纯功能性RPE片层的生成。尽管在临床试验中已为AMD患者安全地进行了人类ESC衍生的RPE悬浮液的移植5，但悬浮的RPE很难自组织成患者神经视网膜下的功能性单层膜，限制了长期移植RPE35的存活率和有效性。或者，生产和移植功能性RPE床单可以改善被移植的RPE13、23、36的生存前景。在美国，我们试图生产出高功率半导体激光器（hiPSC）衍生的可用于此类应用的RPE片材。我们首先评估了RPE6iN诱导的细胞传代的纯度。在NIC处理下，一次性传代诱导的RPE可观察到更多的MITF阳性细胞（99%）和较少的CHX10阳性细胞（0.5%）（图3A）。NIC处理显著增加了MITF阳性细胞（图3B）。结果表明，RPE6iN诱导的RPE细胞一次传代可获得高纯度的成熟RPE片。我们将RPE6iN诱导的RPE细胞接种到Transwell上，使RPE生长成成熟的上皮层37。以培养周期依赖的方式，将内质网植入转孔四周后，RPE细胞的色素沉着增加（图3C，D）。e-RPE表现为沿顶端-基底轴的极化上皮结构，这是成熟RPE的典型特征。为了检测RPE片的顶端-基底极性和成熟度，我们评估了位于顶端区的紧密连接蛋白ZO-1和位于RPE基底外侧质膜上的通道蛋白Bestrophin-1（BEST1）的表达。ZO-1表达于RPE片的顶区，而BEST1表达于基底外侧（图3E）。ese结果表明，hiPSCRPE薄片是成熟的，并且在顶端-基底方向极化，与之前的研究-2,38一致。接下来我们检查了RPE成熟和极化相关基因的表达。qPCR分析表明，RPE6iN诱导的细胞表达典型的成熟RPE标记物：RPE65，一种与维甲酸周期相关的酶；CRALBP，一种参与维甲酸循环的维甲酸结合蛋白；VEGF，一种从RPE基底侧释放的生长因子；PEDF，一种从RPE顶端释放的生长因子。hiPSC-RPE表显示四个基因的表达水平较高（图3F）。综上所述，由RPE6iN诱导的细胞产生的薄片具有成熟RPE的典型特征，包括色素沉着，多边形和极化形态，以及负责紧密连接，极化细胞因子分泌和视觉循环的基因和蛋白质的表达。

感光细胞层的主要功能是由感光细胞的外段吞噬。因此，我们用pH-Rhodo标记的生物制品评价了hiPSC-RPE片的吞噬能力。在37°C下暴露4小时后，在RPE片的顶端和细胞质位置观察到大量的前驱生物颗粒（图3G）。相反，在阴性对照（4°C）下，RPE表显示出很少的荧光信号（图S4）5。结果表明hiPSC-RPE片具有吞噬功能。势垒函数是高极化RPE片材的另一个重要特性。termeasurement常用于测量RPE片材的阻隔功能，灵敏度高，可靠性高20,37。为了评估hiPSC-RPE片材的势垒功能，我们测量了不同时间点的TER值。培养期间，hiPSC-RPE片的末端值增加（图3H）。即使在相同的培养条件下，RPE片间的e-TER值也不相同，有些RPE片没有达到较高的TER值（图3H），这与之前的研究19,23一致。我们得出结论，功能性RPE片是在Transwell上进一步培养纯hiPSC-RPE细胞而产生的，并且hiPSC-RPE片的质量因批次而异。

图3.生成成熟的功能性hiPSC衍生的RPE细胞片层。（A）代表性的显微照片，显示显示了经RPE6iN处理的细胞中MITF和CHX10的表达。HiPSC在NIC存在或不存在的情况下进行分化，并重新接种以继续培养7天。（B）NIC治疗后MITF阳性细胞的百分比。与对照相比，***P0.。使用NIC处理区分HiPSC，重新接种以进行扩展培养，然后进行免疫细胞化学分析。（C）经RPE6iN处理的细胞的片层形成。将HiPSC-RPE片接种在Transwell装置上后，应保持2和4周。（D）4周培养后的hiPSC-RPE片的宏观照片。（E）hiPSC-RPE片材的成熟。代表性的x-y截面和x-z截面图像显示，RPE薄片既表达ZO-1（位于根尖附近的紧密连接标记），又表达成熟的RPE的基底外侧标记BEST1。接种后，将RPE6iN诱导的RPE细胞在transwell上培养4周，然后进行免疫染色。（F）hiPSC-RPE片的成熟度。使用RT-qPCR定量RPE6iN诱导的RPE细胞（分化第24天）和RPE片相对于未分化的hiPSC的RPE65，CRALBP，PEDF和VEGF的基因表达。与RPE细胞相比，*P0.05，***P0.。（G）hiPSC-RPE片的吞噬能力。分别在37°C下用生物颗粒培养的hiPSC-RPE薄片的代表性x–y截面（上图）和x–z截面图像（下图）。pHrodo-Green共轭的生物制品（绿色）在低pH值下发荧光，表明生物制品被吞噬。F-肌动蛋白（品红色）通过鬼笔环肽标记。（H）hiPSC-RPE片材的阻隔性能的评估。接种在Transwell上2和4周后，在Transwell上测量hiPSC-RPE薄片的TER值。比例尺：20米（A、E、G）和米（C）。

低TER值的hiPSC-RPE板中的异常紧密连接，粘附连接和F-肌动蛋白细胞骨架。给定hiPSC-RPE板之间TER值的可变性（图3H），我们检查了TER值高和TER值低的RPE板之间的电位差。许多证据表明紧密连接和粘附连接对于屏障功能都是必不可少的40，41。鉴定到ZO-1在RPE细胞顶侧紧密连接中的定位（图S5A）。我们首先评估ZO-1如何在具有低TER值的hiPSC-RPE片材中分布。由于已经报道了人RPE单层体内的TER值为Ω·cm37,42，因此我们将TER值Ω·cm2的hiPSC-RPE板分类为高TER值组。TER值Ωcm2的HiPSC-RPE纸被分类为低TER值组。在具有高TER值的RPE板材中，ZO-1以具有鳞状外观的多边形形态分布（图4A）。但是，低值的RPE板料中的ZO-1缺乏典型的鳞状图案，ZO-1表达不完整。此外，由于存在多个细胞层，ZO-1定位于TER值较低的RPE片的基底外侧（图4A，S5C），而ZO-1分布于TER值较高的RPE片的顶侧细胞之间（图4A）。接下来，我们将重点介绍由钙粘着蛋白和连环蛋白组成的粘附连接点43。钙黏着蛋白是维持上皮细胞完整性的必要条件44，而连环蛋白则与肌动蛋白的哀叹联系在一起。三种主要的钙黏着蛋白，N-，E-和P-钙黏着蛋白，都位于RPE细胞的外侧膜上45。我们发现N-钙粘着蛋白与侧向F-肌动蛋白在细胞间膜中共定位（图S5B）。为了确定在故障的RPE床单中粘附的连接蛋白是否也丢失，我们检查了RPE床单中N-钙粘蛋白的分布方式。在具有高TER值的RPE薄片中，N-钙黏着蛋白从顶端到基底侧位于细胞的侧膜（图4B）。在具有低TER值的RPE片材中，N-钙黏着蛋白表达丢失（图4B）。这些结果表明，在具有低TER值的hiPSC-RPE薄板中，紧密连接和粘附连接均无序。

粘附连接与细胞中F-肌动蛋白的组织有关43。肌动蛋白细胞骨架的异常会影响黏附连接的形成和微哀的破坏，扰乱细胞间黏附力46-48。正常的极化RPE细胞在跨细胞膜微绒毛，周向微细束和基底膜折叠中具有F-肌动蛋白49。但是，越来越多的证据表明F-肌动蛋白分布不规则。

RPE和AMD患者的RPE≥50。还已经表明，细胞骨架会影响上皮片中根尖表面积的分布51。我们，为了检查细胞骨架与RPE床单质量的关系，我们确定了F-肌动蛋白在RPE床单中的分布方式。F-肌动蛋白位于TER值较高的RPE片中的圆周束中，而在TER值较低的RPE片中则更为不利（图4C）。我们进一步评估了F-肌动蛋白的亚细胞定位，并发现具有低TER值的RPE片中某些RPE细胞的侧向和基底F-肌动蛋白丢失，而F-肌动蛋白则均匀地定位于F-肌动蛋白的顶，中央和基底侧。具有较高TER值的RPE板（图4D，S5D）。这些结果表明，具有低TER值的hiPSC-RPE片材在外侧和基底侧损失了F-肌动蛋白。我们得出的结论是，具有低TER的RPE薄片失去紧密的连接和粘附连接，并具有不规则的F-肌动蛋白定位。

RPE板的TER值的基于形态的预测模型。为了临床应用，任何具有异常屏障功能的RPE薄片都需要在薄片移植之前进行检测并消除。我们的研究结果表明，由于F-肌动蛋白分布的差异，低TER值的RPE片与高TER值的RPE片的细胞形态不同。VEGF分泌是RPE功能的关键参数之一。然而，VEGF分泌的定量在不同的实验中有所不同，因为从ELISA中获得的VEGF值受RPE细胞数量、培养基数量和分泌VEGF积累时间的影响。与酶联免疫吸附法（ELISA）相比，TER法测定血管内皮生长因子具有更高的重现性和可靠性。我们假设基于RPE细胞形态的TER预测方法可以无创地识别异常的RPE片。

我们力图使用hiPSC-RPE板中的F-肌动蛋白标记的细胞来开发基于形态的预测模型。图5A中表示了用于数据集构建和基于形态学的预测的工作流。通过聚类分析多个形态学特征（图S6和表S2）及其实验确定的TER值，发现形态学特征包括几个亚种群类型的变种，与主要趋势相比，它们具有不同的相关性（图S7A）。这些结果暗示了RPE薄片的生物异质性，这在分析中可能是噪音。为了构建一个通用的形态模型来预测TER值，我们因此清洗了样本，以包括那些与TER值相关的样本，以进行降噪和多数提取（图S7B）。我们从TERΩcm-2的低TER值组中选择了30个样本，从TERΩcm-2的高TER值组中又选择了30个样品。使用这些形态学数据集（16个形态学参数）和TER值，我们构建了两种类型的预测模型：（1）TER值预测模型和（2）高与低TER判别模型。

仅使用RPE薄片的形态特征，TER值预测模型就可以以低错误率预测TER值（图5B）。高TER样品和低TER样品均与形态参数组合呈线性相关。在模型中，分配给形态参数的主要权重是“负面影响”，是“长/宽比平均值”和“紧密度SD”，而对于正面效果，是“宽度平均值”和“长/宽比SD”（表S3））。这些形态学特征可以解释为表明当细胞无序且形状异质时（即长细胞和短细胞的变异性较大），TER值较低。形态学解释对于TER判别模型也是有效的（图5C）。仅使用形态参数，识别性能就很高（准确度：99％，灵敏度：98％，特定城市：％）。关于判别模型中的权重，“紧密度SD”显示出最强的负面影响，而“平均宽度”显示出最强的正面影响（表S4）。这些权重组合可以解释为描述与TER值预测模型相同的表型。

尽管形态学在预测TER值中的重要性是显而易见的，但是仅使用标记图像构建的模型不能用于RPE片培养过程中的非侵入性评价。为了使我们的形态学模型更实际地适用于各种设备，我们试图使基于标记图像的预测模型适应于未标记图像的形态学信息。为了实现这一点，我们选取了6个样品，用RPE薄片的相衬显微镜图像，并在图像中描绘出清晰可见的细胞边界。选择低TER样品（±12Ωcm-2）和高TER样品（±26Ωcm-2）（图5A）。有了ImageJ插件细胞魔术棒和最小的手动协助，额外的细胞形态学分析可以自动处理，即使是从非标记图像（图S8）。用此方法测得的e细胞被转换成16个相同的解释参数集，然后用上述预测模型进行评估。在所选样本中，尾值预测模型表现良好。TER值预测模型（图5D）低估了TER值较高的一个样本。当用TER判别模型分析样本时，判别性能是实际有效的（准确度：88%，灵敏度：88%，特异性：88%）（图5E）。因此，我们的基于形态学的带标记图像的质量预测模型可以很容易地适用于非标记样本的评价。

接下来，我们研究了我们的预测模型是否能够预测其他hiPSC细胞系产生的RPE表的TER值，这些细胞系是通过不同设施的其他分化协议产生的。六张hiPSCRPE表来自临床制造设备的不同细胞系4。ree-RPE薄片来源于hiPSC的iRTA-01线，两片来自G1线，一片来自Ff-I01线。对六张hiPSC-RPE切片的未标记图像进行形态学分析和基于D6线的预测模型。我们的模型能够预测所有的RPE值。多个hiPSC系的RMSE值为81，而用于模型构建的hiPSC系的RMSE值为82。不同细胞系的预测性能与亲本细胞系内的预测性能相当。这些结果表明，我们基于形态学的预测方法可以成功地应用于其他设备和RPE表的数据。我们得出的结论是，排除基于hiPSC的机器学习表可以提高hiPSC学习的准确性。

我们开发了RPE6iN诱导hiPSC向RPE细胞分化的分化方法，无需特殊选择即可制备高纯度RPE细胞和成熟RPE片。我们还从F-actin标记的图像中构建了一个基于机器学习的无创TER预测模型，用于区分低TER的RPE片。is预测模型也被扩展到实际有效的应用于非标记的RPE图像，即使是在不同的细胞系和设施。由于每一个单元产品的检测和识别是单元制造所必需的，我们基于图像的无损预测模型将有助于在制造过程中识别出故障产品。利用RPE6iN处理的hiPSC高效制备纯RPE片材，结合基于形态学的功能预测系统，将有助于RPE片材工业化生产和质量控制，促进细胞疗法的发展。

一些证据表明侧膜在上皮功能中的重要性51，52。低TER值的hiPSCRPE片容易丢失侧F-肌动蛋白，这与侧F-肌动蛋白在维持上皮结构中的重要性一致。我们发现RPE表中堆积的细胞具有较低的TER值。RPE片失去上皮结构的一个潜在原因是，RPE细胞在生长达到融合状态后仍保持着增殖潜能。与不能多次传代的人胎儿RPE不同，hPSC-RPE细胞在13次传代后仍能保持上皮细胞形态53，提示hPSC-RPE具有增殖潜能。然而，当移植治疗需要功能性RPE片时，增殖潜能可能使hPSC-RPE分化为成熟和极化。阻断细胞周期可以促进RPE膜的成熟和极化、纤毛形成和ter54值，这表明控制细胞增殖对RPE成熟非常重要。总之，控制细胞增殖和顶端-外侧轴的收缩平衡可以提高高质量RPE片的生产。这可能有助于开发一个合适的培养条件，以产生功能性RPE细胞。

建立稳定、可重复的分化细胞质量控制体系是hPSC临床应用的迫切任务。据报道，由于长时间人工操作细胞培养，hiPSC-55和hiPSC衍生产品（如心肌细胞56）存在差异。生成的RPE细胞的质量也可能因不同的hiPSC线13和同一hiPSC线57中的不同协议而不同。与先前的报告19,23一致，我们还发现，即使使用相同的hiPSC细胞系和相同的培养方案，RPE细胞之间的TER值也有所不同。再生医学细胞制品的产业化，必须保证每一种产品都是功能齐全的。然而，几乎不可能评估每个RPE细胞的功能。在美国，开发区分合格和不合格的RPE细胞的方法对再生医学至关重要。

图4.低TER值的hiPSC-RPE细胞薄片中异常的细胞骨架结构。（A）在x–y共焦部分（上图）和x–z共焦部分（下图）中，TER值较高（Ωcmand2）和较低（Ωcm-2）的hiPSC-RPE薄板的ZO-1分布。x–z共焦部分代表ZO-1（品红色）和原子核（绿色）的合并图像。REP6iN处理的hiPSC在超孔中培养，并进行TER测定和免疫染色。箭头指示ZO-1的错误定位。（B）具有高（Ωcm-2）和低TER值（Ωcm-2）的RPE纸的N-钙粘着蛋白和F-肌动蛋白染色的代表性显微照片。箭头指示N-钙黏着蛋白低表达的细胞。（C）hiPSC-RPE片中的F-肌动蛋白分布。代表性的鬼笔环肽在TER值较高（Ωcm×2）和较低（93Ωcm2）的RPE纸中进行F-肌动蛋白染色。RPE6iN诱导的RPE细胞在超孔中培养，并进行TER测定和鬼笔环肽染色。（D）在hiPSC-RPE片中F-肌动蛋白的亚细胞定位。使用相同的成像设置获得代表性图像，分别在单独的xy共焦部分中显示F-肌动蛋白（品红色）和核（绿色）。分别显示了细胞顶端，内侧和基底的各个部分，以及具有高（Ωcm-2）和低（93Ωcm-2）TER值的RPE片材相同区域的x–z截面。比例尺：10m（D），20m（A，B）和50m（C）。

本研究中的所有实验均在名古屋大学的批准下进行，并符合名古屋大学的指导原则。

人类iPSC的文化。人类iPSC品系（克隆：D2和D6）是在无饲养层的条件下从非HLA纯合子供体产生的，由京都大学iPS细胞研究中心的中川雅人博士（MasatoNakagawa）和山中伸弥（ShinyaYamanaka）博士提供24。京都大学研究生院医学系伦理学委员会审查委员会批准了针对人体的实验方案。每个捐助者均提供了书面知情同意书。克隆D2和D6是通过ve个质粒（pCE-hOCT3/4，pCE-hSK，pCE-hUL，pCE-mp53DD和pCXB-EBNA1）从外周血细胞产生的，以诱导多能性。人iPSC品系（克隆：A）购自ThermoFischer。克隆A由CD34+人脐带血细胞通过7种因子SOX2，OCT4，KLF4，MYC，NANOG，LIN28和SV40LT抗原的三种附加型载体产生。将人iPSC保持在StemFitAK02N（味之素，日本东京）24上涂有iMatrix（日本东京的Nippi公司）的培养皿中。为了进行传代，当hiPSC几乎生长到汇合时，将hiPSC用Accutase处理（NacalaiTesque，日本京都，日本），解离成单个细胞，然后以5.0×细胞/cm2的浓度重新铺在AK02N中的iMatrix涂层培养皿上10MY-（日本大阪市和光市）持续24小时。在接种的第二天将培养基更换为不含Y-的新鲜培养基，每2天增加一次。hiPSC保持在5％CO的潮湿环境中和95％的空气在37°C下。本研究使用第6至13代的hiPSC来确保多能性。来自克隆D6的数据显示在“结果”和数字，除非另有说明。

RPE分化和RPE片材生产。为了分化，未分化的hiPSC用accutase处理5分钟，分离成单个细胞，并以3.0×个细胞/孔的速度，将未分化的hiPSC以3.0×个细胞/孔的速度镀到iMatrix涂层的6孔培养板（ThermoFisherScientic，Waltham，MA）上。对于RPE诱导，将nMLDN（Sigma，St.Louis，MO）、nMA-83-01（Wako）、1MIWR-1-endo（Wako）和10MY-添加到IMDM/Ham的F12（1:1，均来自Sigma）中，并辅以10%敲除血清置换（ThermoFisherScientic）、0.5mM单硫代甘油溶液（Wako）处理细胞，最初6天使用1%化学去脂浓缩物（Wako）和2mMl-谷氨酰胺（Wako），然后在IMDM/F12中加入3MCHIR（Wako）、2MSU（Wako）和10MY-，持续12天。从第18天开始，培养基改为DMEM/F12（Sigma），补充10%敲除血清，1%N2补充（Wako）和2mMl-谷氨酰胺。在一些实验中，从第12天到第24天添加10mM烟酰胺（Wako）。为进一步成熟，将hiPSC-RPE在RPE维持培养基（67％高葡萄糖DMEM（Wako），29％HamsF12、2％B27）中培养补充剂减去维生素A（赛默飞世尔科技公司），2mM谷氨酸盐，U/mL青霉素和g/mL链霉素，每天更换新鲜培养基。

对于RPE薄片生成，将hiPSC-RPE用0.25％胰蛋白酶-EDTA（Wako）处理10分钟，然后通过移液将其分离成单个细胞。通过穿过35m细胞过滤器（Corn-ingInc.，Corning，NY）改变细胞，然后将其铺在用于功能分析的iMatrix涂层的12孔transwell插入物（Corning）或iMatrix涂层的6孔中。培养板进一步增殖。为了进行功能分析，将hiPSC-RPE培养在含有10％胎牛血清（ThermoFisherScientific），Ham’sF12、2mM谷氨酸，U/mL青霉素和g/mL链霉素的RPE生长培养基中。14天后，用含有10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（Wako）和0.5MSB（Wako）13的RPE维持培养基替换hiPSC-RPE生长培养基。使用所有细胞直到第3代。

实时定量聚合酶链反应。使用组织总RNA微型试剂盒（台湾，FavorgenBiotechCorp.）提取hiPSC和分化细胞的总RNA，然后根据制造商的说明用PrimeScriptRTMasterMix（TaKaRa，日本滋贺市）进行逆转录。使用TBGreenFastqPCR混合液（TaKaRa）在LightCycler96系统（Roche，Indianapolis，IN）上进行实时定量PCR。将表达水平相对于GAPDH标准化。所用的引物在表S1中列出。

图5.hiPSC衍生的RPE板材基于形态的TER值预测。（A）图像处理，特征提取，层次聚类和预测建模的示意图。（B）使用F-肌动蛋白标记的图像对hiPSC-RPE薄片功能进行预测建模。图表显示了机器学习的F肌动蛋白标记图像的形态特征相对于测得的TER值的TER预测性能。黑色对角线代表完美的预测。RMSE：根表示平方误差。（C）使用F-肌动蛋白标记的图像对hiPSC-RPE薄片进行二选区分。F-肌动蛋白标记图像的形态特征相对于F-肌动蛋白标记图像的测试样品的TER判别图。红色图表示高TER值的测试样品。蓝色图代表低TER值的测试样品。（D）使用无标签的相位对比图像预测hiPSC-RPE纸张功能。该图显示了机器学习的F-肌动蛋白标记图像的形态特征相对于相衬图像中测得的TER值的TER预测性能。黑色图表示用于TER值预测模型构建的样本。红色图表示高TER值的测试样品。蓝色图代表低TER值的测试样品。（E）使用无标签的相位对比图像对hiPSC-RPE纸张进行二选区分。F-肌动蛋白标记图像的形态特征相对于相衬图像测试样本的TER判别图。红色曲线表示具有较高TER值的测试样品。蓝色图表示具有低TER值的测试样品。

免疫细胞化学。如前所述[6]对细胞进行免疫标记。用PBS洗涤细胞，然后在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）中的4％多聚甲醛固定15分钟。用0.1％Triton漂洗3次后，用封闭液（NacalaiTesque）封闭细胞1小时，然后与一抗在4°C下孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将细胞与适当的第二抗体和DAPI（Wako）在室温下孵育2小时。一抗及其工作稀释度如下：小鼠抗Oct3/4（1：1,，BDPharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚），小鼠抗Mitf（1：，Abcam，Cambridge，MA），兔抗Pax6（1：，Covance，慕尼黑，德国），兔抗Pax6（1：，Abcam），绵羊抗Chx10（1：，ExalphaBiologicals，Shirley，MA，美国），兔抗ZO-1（1：，ThermoFisherScientific），小鼠抗-Bestrophin（1：，Abcam）和小鼠抗N-钙粘蛋白（1：，CellSignalingTechnology，丹佛斯，马萨诸塞州，美国）。使用的二抗如下：与Alexa或Alexa（1：1,，JacksonImmunorThesearchLaboratoriesInc.，WestGrove，PA）缀合的抗小鼠IgG，抗兔IgG和抗绵羊IgG。为了标记F-肌动蛋白，将固定细胞用封闭剂处理1次，然后在室温下用罗丹明标记的鬼笔环肽（Wako）和DAPI处理2小时。对于HiPSC的凝集素标记，将固定细胞用第一个封闭物封闭，然后在室温下用FITC标记的重组BC2L-CN末端域（rBC2LCN-FITC，Wako）和DAPI处理2小时。标记的细胞用带有GaAsP检测器（LSM，蔡司，耶拿，德国）的共焦激光扫描显微镜成像，使用20倍物镜（NA0.75，蔡司）或40倍物镜（NA1.2，蔡司）。

为了评估hiPSC-RPE的纯度，将细胞用0.25％胰蛋白酶/EDTA处理15分钟，通过轻轻移液将其分离成单个细胞，通过一个35m的细胞滤网，然后接种在iMatrix涂层的3.5cm培养皿中密度为1.0×格/cm2。将细胞在RPE生长培养基中培养7–8天，直至融合。在室温下，将细胞用PBS中的4％多聚甲醛固定15分钟，然后用抗Chx10和抗Mitf抗体进行免疫染色。标记的细胞用带有GaAsP检测器的共聚焦激光扫描显微镜成像。随机选择至少三个视野。计数PAX6阳性细胞和MITF阳性细胞的数量。一个样品中计数了多个细胞。将细胞纯度确定为阳性细胞数占总细胞数的百分比。

跨上皮电阻（TER）测量。使用电阻系统（Millicell，Millipore，Billerica，MA）将hiPSC-RPE接种在transwell插入物上进行TER测定。将电阻系统的测试电极连接到仪表的输入端口，并确认其值为0Ω。用70％乙醇冲洗电极15分钟，然后用RPE维护介质冲洗15分钟。从培养箱中取出后10分钟内进行测量，以避免温度降低。通过从实验值中减去空白插入物的值，然后乘以插入物膜的面积，可以计算出净TER（Ωcm2）。

吞噬作用测定。将hiPSC-RPE片在含有7gpH-Rhodo标记生物颗粒（ThermoFisherFisherScientific）的RPE维持培养基中于37°C的培养箱中培养4h。作为阴性对照，hiPSC-RPE片在pH-Rhodo标记的生物颗粒存在下于4°C培养。用在PBS中的4％多聚甲醛固定细胞，用PBS洗涤3次，并用鬼笔环肽和DAPI染色。荧光信号用带GaAsP检测器的共焦激光扫描显微镜使用20倍或40倍物镜成像。

图像处理和预测模型分析。F-肌动蛋白标记的显微图像（总共54张图像，20倍放大倍数）由CL-Quant（日本东京的尼康公司）根据制造商的规程设计后来的产品，进行了处理。图S6示出了标记图像处理和形态特征测量过程。单元识别后（图S6A），尺寸小于像素（平方米）的单元会从识别的单元数据中删除，因为它们倾向于包含错误识别的物体或噪声。清理数据后，通过CL-Quant测量了8种形态特征：（1）面积，（2）紧密度，（3）内半径，（4）长度，（5）纵横比，（6）外半径，（7）周长和（8）宽度（表S2）。仔细选择了形态特征以消除多重共线性问题。在从每幅图像测量细胞对象之后，从原始数据中生成了三个重复的数据集，其中包括通过引导从总细胞中随机选择的–个细胞。对于个样本（=54张图像×3），总结了-个细胞的每个平均值（AVE）和标准差（SD），并列出了每个样本的解释变量集（16个参数）（图S6B）。将每个细胞样品的实验确定的TER值（范围从70到Ωcm2）标记为客观变量。

在构建预测模型之前，应用层次聚类（平均链接）来分析数据分布（图S7A）。聚类表明，总数据可以分为两组：一个聚类，大多数与高TER相关（A组，右聚类），另一个聚类，大多数与低TER相关（B组，聚类）簇）。尽管在形态学模式与其功能性TER值之间通常存在相关性趋势，但也存在不遵循该模式的样品亚群。在此分析中，我们对“主要形态相关性”进行了建模。选择来自A组的样品（TER）和来自B组的样品（TER）作为“代表TER值的原代细胞”。如前所述，使用最小绝对收缩和选择算子回归构建了TER预测模型和TER阳性（TER）或阴性（TER）判别模型。选择的样本（总计n=98）用于训练模型。为了检查其对模型的预测性能，绘制了实验确定值（TER值，x轴）和预测值（仅根据形态特征，y轴的TER值）的相关性。还通过均方根误差（RMSE）值来评估性能，该均方根误差表示实验确定的值与预测值之间的误差。计算准确性，敏感性，特异性及其预测概率，以评估歧视表现。通过留一法交叉验证来验证绩效。

为了将构建的形态学TER预测模型应用于未标记的相衬显微图像，这2个批次（6个样本）显示出较高的TER（平均TER值为±26Ωcm2）和较低的TER（平均TER值为±选择12Ωcm2）进行图像处理和预测（图5A和S8）。从未标记的图像中，使用ImageJ/Fiji中的CellMagicWand工具（